基因富集分析 (gene set enrichment set analysis)_GO/ GSEM/ KEGG_R語言－風中一匹狼

#基因富集分析 (gene set enrichment set analysis)

#數據庫下載: 與自己的差異基因進行搜尋及比對
#AnnotationHub是生物數據庫的中轉站，方便搜尋目標數據，另一個相似套件為biomaRt
#參考網址:https://www.jianshu.com/p/ae94178918bc
source("https://bioconductor.org/biocLite.R")
install.packages("BiocManager")
BiocManager::install(c("AnnotationHub","BiocGenerics","parallel"))
library(AnnotationHub)
ah <- AnnotationHub()
ah

#版本是2018-08-20; 目前有45768條紀錄
unique(ah$dataprovider) #數據來源
unique(ah$species) #支持那些物種
ah$species[which(ah$species == "Gallus gallus")] #查詢Gallus gallus是否存在資料庫中
gallus <- query(ah, "Gallus gallus")
gallus #列出有 "Gallus gallus"這個物種的資料庫有哪些
ah[ah$species == "Gallus gallus" & ah$rdataclass == 'OrgDb']
subset(ah, species == "Gallus gallus" & rdataclass == 'OrgDb') #用R內建功能查詢有"Gallus gallus"且屬於'OrgDb'的數據庫
display(ah) #圖形化介面操作
deseq2.sig <- subset(res, padj < 0.05 & abs(log2FoldChange) > 1) #數據篩選，p<0.05，且log2>1
unique(ah$rdataclass) #AnnotationHub的註解訊息存放格式
gallus["AH61772"]
org_gal<-ah[["AH61772"]] #[[]]為下載數據庫，編號就是對應自己要搜尋的數據庫
str(org_gal)
mode(org_gal) #調查數據模式為S4
class(org_gal)
keytypes(org_gal);columns(org_gal) #搜尋可以輸入的基因名稱格式 (兩種函數皆可)

keys(org_gal,keytype = "ENTREZID") #查詢某一基因輸入格式有那些,keytype指定輸入格式
select(org_gal,keytype = "SYMBOL" ,keys= "ENO1", columns= c( "UNIGENE","GENENAME","ENTREZID","GO")) #從資料庫搜尋基因。
#key:關鍵字(須符合基因格式);column:欲列出的項目(格式)，一個基因有時會有多個GO

#GO分析
BiocManager::install("clusterProfiler") #使用富集分析會用到的package
library("clusterProfiler")
BiocManager::install("fgsea")
library(readxl) #可以讀入excel的package
# 以這組基因列表當練習: https://drive.google.com/open?id=1KTrQqok9cm5kPneo-Z8dWGEHaCNseUjp
#引用來源: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0306456518302456?via%3Dihub#f0020
#由於該文獻只有提供GI number，所以用DAVID的Gene ID Conversion Tool轉換成ENTREZ，不過原本有103個差異基因，轉換後只對的到70個
GO<-read_xlsx("GO.xlsx",col_names = T) #輸入資料，差異表達的基因 (ENTREZID命名格式)
BiocManager::install("enrichGO")
library(DOSE)
GO_BP <- enrichGO(gene =as.character(GO$ENTREZ_GENE_ID), #輸入的基因列表需轉換成字元
OrgDb = org_gal, #物種註釋數據庫，使用NCBI的database
keyType = "ENTREZID", #gene命名格式
ont= "BP", #選擇基因功能: 是BP (Biological Process), CC (Cellular Component), MF (Molecular Function)
pAdjustMethod = "BH",
pvalueCutoff = 0.05,
qvalueCutoff = 0.2,
minGSSize = 10, #每個基因集最小數目
maxGSSize = 500, #用於測試的基因註釋最大數目
readable = FALSE,
pool = FALSE)
write.csv(summary(GO_BP),"GO_BP.csv",row.names =FALSE) #寫出GO分類表格

dotplot(GO_BP,x= "GeneRatio",font.size= 10,color ="p.adjust",showCategory = 20) #泡泡圖, x可以改成以"count"表示，font.size: 文字大小; showCategory: 顯示的分類數，從p值最小的開始顯示。其他像是格式或是圖形樣式也可以變換，但我還沒摸熟。

barplot(GO_BP,x="GeneRatio",font.size= 10) #也可以繪製長條圖

enrichMap(GO_BP, vertex.label.cex=1.2, layout=igraph::layout.kamada.kawai) #該功能無法再使用，改成emapplot()
emapplot(GO_BP, showCategory = 20, color = "p.adjust", layout = "kk",vertex.label.cex=1.2) #網絡圖

library(stringi)
BiocManager::install("topGO")
BiocManager::install("Rgraphviz")
plotGOgraph(GO_BP) #GO圖

#GSEA分析
genelist<- GO$foldchange #指定基因差異的倍數，或是其他差異的程度
names(genelist)<- GO$ENTREZ_GENE_ID #差異倍數綁定基因名稱
genelist <- sort(genelist , decreasing = T) #排序差異程度高到低 (為符合格式需求)
gsemf<- gseGO(geneList = genelist, ont = "BP", OrgDb= org_gal, keyType = "ENTREZID", exponent = 1,
nPerm = 1000, minGSSize = 10, maxGSSize = 500, pvalueCutoff = 0.05,
pAdjustMethod = "BH", verbose = TRUE, seed = F, by = "fgsea")
#若排序的有相同的值就會無法計算 https://www.biostars.org/p/222431/
head(gsemf)
#由於這組genelist的pvalue= 0.05的話會沒有資料 (no term enriched under specific pvalueCutoff)
gseaplot(gsemf, geneSetID=1)

#因此使用範例演示
library(DOSE)
data(geneList)
x <- gseDO(geneList)
gseaplot(x, geneSetID=1)

#KEGG
kk <- enrichKEGG(as.character(GO$ENTREZ_GENE_ID), organism="gga",
keyType = "ncbi-geneid",
pvalueCutoff=0.05, pAdjustMethod="BH",
qvalueCutoff=0.1)
head(summary(kk))
dotplot(kk)

#查看特定pathway
BiocManager::install("pathview")
library(pathview)
hsa04750 <- pathview(gene.data = geneList,

pathway.id = "hsa04750", #上述結果中的hsa04750通路

species = "hsa",

limit = list(gene=max(abs(geneList)), cpd=1))

#以上分析主要參考來源:　https://www.plob.org/article/11508.html